Pruebas específicas para el diagnóstico de linfoma y neoplasia linfoproliferativas

Pruebas específicas para el diagnóstico de linfoma y neoplasias linfoproliferativas

Francisco J. Alvarez Berger DVM, MS, DACVIM (Oncología)

En la mayoría de los perros y gatos, el diagnóstico de linfoma puede realizarse mediante la citología de un aspirado con aguja fina de los ganglios linfáticos u otros órganos afectados. Sin embargo, en un porcentaje relevante de casos la citología, e incluso la histopatología, no permiten distinguir con seguridad un linfoma de una hiperplasia linfoide reactiva, ni definir el tipo celular del que se origina la neoplasia. En estos escenarios se dispone de un conjunto de pruebas complementarias (inmunohistoquímica, inmunocitoquímica, citometría de flujo y pruebas de clonalidad por PCR) que, bien seleccionadas e interpretadas en conjunto, confirman el diagnóstico, establecen el inmunofenotipo y aportan información pronóstica. Este artículo describe el fundamento, las indicaciones, el manejo de la muestra y las limitaciones de cada prueba, y propone una guía práctica para elegir la más adecuada según el contexto clínico.

Citología: el punto de partida y sus limitaciones

Un diagnóstico citológico de linfoma suele ser sencillo cuando el aspirado muestra una población monomorfa de linfocitos de tamaño intermedio a grande, que es la presentación de los linfomas de alto grado, los más frecuentes en el perro. La dificultad aparece en tres situaciones: la hiperplasia linfoide marcada, que puede imitar a un linfoma; los linfomas de células pequeñas (de bajo grado o indolentes), que presentan pocos criterios citológicos de malignidad; y las muestras poco celulares o de localización anatómica difícil.

Al obtener una muestra para citología o biopsia se debe evitar el muestreo de ganglios linfáticos de zonas reactivas, por ejemplo:

• Ganglios linfáticos mandibulares en pacientes con enfermedad periodontal.
• Ganglios linfáticos poplíteos en pacientes con pododermatitis de los miembros pélvicos.
• Ganglios linfáticos prescapulares en pacientes con otitis crónica.

Se recomienda muestrear el ganglio linfático aumentado de tamaño más representativo y alejado de focos inflamatorios, y preparar varias laminillas sin cubreobjetos, ya que pueden utilizarse después para inmunocitoquímica o PCR de clonalidad. En los casos en que la citología no es concluyente, es necesario recurrir a otras modalidades diagnósticas para confirmar o descartar el linfoma.

Histopatología: la prueba de elección

La biopsia para evaluación histopatológica se considera la prueba de elección para el diagnóstico de linfoma cuando es posible obtenerla. Permite evaluar la arquitectura del ganglio linfático, establecer el grado histológico y, junto con la inmunohistoquímica, clasificar el linfoma según los criterios de la Organización Mundial de la Salud adaptados al perro (Valli et al., 2011). Es preferible la extirpación completa de un ganglio linfático periférico (evitando, de nuevo, los mandibulares si hay enfermedad oral) a la biopsia con aguja de corte, porque la arquitectura es indispensable para reconocer subtipos como el linfoma de zona T, el linfoma de zona marginal o el linfoma folicular.

La histología también puede dar resultados no concluyentes: los perros con linfomas de bajo grado pueden ser diagnosticados como hiperplasia linfoide, y en el gato la diferenciación entre enteritis linfoplasmocítica y linfoma intestinal de bajo grado sigue siendo un reto aun con biopsias de buena calidad. Cuando los resultados citológicos o histológicos son ambiguos, se requieren pruebas adicionales basadas en un mismo principio: una neoplasia implica la expansión de un solo clon, lo que produce una población homogénea de linfocitos con el mismo fenotipo y el mismo reordenamiento del receptor de antígeno, mientras que la hiperplasia reactiva suele ser heterogénea (policlonal) (Keller et al., 2016).

Inmunofenotipificación

El inmunofenotipo determina el tipo celular que compone el linfoma mediante la detección de moléculas específicas de linfocitos B y T. Para ello se aplican anticuerpos contra estos marcadores a secciones de tejido (inmunohistoquímica), a muestras citológicas (inmunocitoquímica) o a células individuales en suspensión (citometría de flujo). En el perro, los linfomas de células B son los más frecuentes; los de células T representan aproximadamente del 30 al 40% de los casos y abarcan entidades de comportamiento muy distinto, desde el linfoma de zona T, indolente, hasta formas muy agresivas (Comazzi y Riondato, 2021). Conocer el inmunofenotipo tiene, por lo tanto, valor pronóstico y puede orientar el tratamiento.

Es importante subrayar que la PCR de clonalidad (PARR) no es una prueba de inmunofenotipificación: aunque informa si el reordenamiento clonal ocurre en el gen del receptor de linfocitos T o en el de la cadena pesada de inmunoglobulinas, existen reordenamientos de linaje cruzado (en algunos casos las células B reordenan los loci de células T o las células T reordenan los loci de células B, e incluso las células mieloides pueden llegar a reordenar loci de células B o T), y las guías de interpretación desaconsejan asignar el linaje con base solo en este resultado; el inmunofenotipo se determina con mayor precisión mediante inmunohistoquímica o citometría de flujo (Keller et al., 2016; Melendez-Lazo et al., 2019).

Inmunohistoquímica (IHQ)

Consiste en la inmunofenotipificación de tejido fijado en formalina e incluido en parafina, con marcadores de células B (CD20, PAX5, CD79a) y de células T (CD3; en algunos laboratorios también CD5), además de marcadores de proliferación como Ki-67 y otros según la sospecha clínica. Ayuda a reconocer un linfoma en los casos dudosos: la identificación de una población homogénea de células neoplásicas T o B que borra la arquitectura normal sustenta el diagnóstico.

• Ventajas: permite al patólogo ver la arquitectura del ganglio linfático y establecer la subclasificación del linfoma con base en la distribución de las células neoplásicas; se realiza sobre el mismo bloque de la biopsia, sin necesidad de muestra fresca, y puede hacerse de manera retrospectiva.
• Limitaciones: requiere biopsia; el número de marcadores que se evalúan en un mismo caso es menor que en la citometría de flujo; algunos linfomas expresan marcadores de ambos linajes o pierden marcadores, lo que puede requerir pruebas complementarias para definir el linaje.

Inmunocitoquímica (ICQ)

Es similar a la inmunohistoquímica, pero se realiza sobre una muestra citológica, como un frotis de aspirado de ganglio linfático, de un derrame o de líquido cefalorraquídeo, y detecta antígenos de células B y T en los linfocitos.

• Ventajas: no requiere biopsia de tejido; puede aplicarse a laminillas ya obtenidas (idealmente sin teñir y sin cubreobjetos) y no exige células viables.
• Limitaciones: la arquitectura del tejido no puede evaluarse; se emplea un panel reducido de anticuerpos, por lo general uno o dos por laminilla; su interpretación depende de la celularidad y de la calidad del frotis, y su disponibilidad varía entre laboratorios.

Citometría de flujo

La citometría de flujo detecta marcadores situados en la superficie (y algunos intracelulares) de los linfocitos, analizando miles de células individuales en suspensión. Además del linaje (CD21 o CD79a para células B; CD3, CD5, CD4 y CD8 para células T), mide el tamaño celular (dispersión frontal de la luz), la intensidad de expresión de cada antígeno y la presencia de aberraciones fenotípicas, como la pérdida de CD45, CD5 o CD3, la coexpresión o ausencia simultánea de CD4 y CD8, la disminución del MHC de clase II o la expresión de CD34. Estas aberraciones se consideran un rasgo distintivo de la neoplasia y ayudan a separarla de la población linfoide residual normal (Comazzi y Riondato, 2021; Riondato y Comazzi, 2021).

En el perro, una población expandida de linfocitos de tamaño grande con un solo fenotipo, junto con escasos linfocitos B y T residuales, apoya la expansión clonal. En los ganglios linfáticos normales y reactivos, en cambio, predominan los linfocitos pequeños y la mezcla de células B, células T CD4+ y CD8+ (Riondato y Comazzi, 2021). A diferencia de la medicina humana, la relación de cadenas ligeras kappa/lambda tiene poca utilidad en el perro, porque las cadenas lambda predominan ampliamente incluso en la población normal (Riondato y Comazzi, 2021).

La citometría de flujo es especialmente útil para reconocer el linfoma de zona T: la pérdida de expresión de CD45 en una población expandida de linfocitos T pequeños es un rasgo diagnóstico específico de esta entidad. En el estudio de referencia, todos los casos CD45 negativos se clasificaron histológicamente como linfoma de zona T, con una mediana de supervivencia de 637 días; alrededor del 40% de los casos ocurrieron en Golden Retriever y la mayoría presentaba linfadenomegalia y linfocitosis (Seelig et al., 2014). La detección de aberraciones fenotípicas también permite confirmar la neoplasia en los linfomas de células pequeñas claras cuando no se dispone de histopatología (Martini et al., 2015).

Las muestras pueden ser sangre periférica con EDTA, médula ósea o aspirados de ganglios linfáticos u otros tejidos y masas, colocados en un medio de preservación. El medio que utilizamos es 0.9 ml de solución fisiológica con 0.1 ml de suero de perro, equivalente a solución salina con 10% de suero canino, el mismo medio descrito en estudios de referencia (Avery et al., 2014). Otros laboratorios emplean medio RPMI o soluciones amortiguadoras con suero fetal bovino; conviene confirmar con el laboratorio el medio y la forma de envío antes de tomar la muestra.

• Ventajas: se obtiene a partir de un aspirado, sin anestesia general; permite usar un panel amplio de anticuerpos en una sola muestra; es rápida; cuantifica la población neoplásica y detecta aberraciones fenotípicas; aporta información pronóstica (tamaño celular, expresión de MHC de clase II, Ki-67) y es útil para la estadificación de sangre y médula ósea.
• Limitaciones: no permite examinar las células en el contexto de la arquitectura del ganglio linfático; requiere células viables, por lo que la muestra debe procesarse idealmente dentro de las primeras 24 horas, refrigerada y sin congelar; los tiempos de tránsito prolongados deterioran la calidad del análisis (Meichner et al., 2020); en los linfomas de células pequeñas o medianas define el linaje, pero no siempre el grado, y no es útil en muestras poco celulares.

La European Canine Lymphoma Network publicó recomendaciones de consenso sobre la información que debe contener un reporte de citometría de flujo: calidad de la muestra, porcentajes y números absolutos de células positivas, puntos de corte, intensidad de fluorescencia y aberraciones de expresión, además de una interpretación descriptiva (Comazzi et al., 2017). Al elegir el laboratorio, es recomendable verificar que sus reportes cumplan con estos elementos.

Concordancia entre pruebas para determinar el inmunofenotipo

En un estudio de 62 perros con linfoma a los que se realizaron las tres pruebas, la concordancia con la inmunohistoquímica fue del 94% para la citometría de flujo y del 69% para la PARR; los autores concluyeron que la citometría de flujo es superior a la PARR para predecir el inmunofenotipo, y que la PARR es una alternativa aceptable cuando no se dispone de una muestra fresca (Thalheim et al., 2013).

PCR para el reordenamiento del receptor de antígeno (PARR)

Fundamento

Durante su maduración, cada linfocito reordena los segmentos V, D y J de los genes de su receptor de antígeno (el gen de la cadena pesada de inmunoglobulinas, IGH, en los linfocitos B y el gen del receptor gamma, TRG, en los linfocitos T), lo que genera una secuencia de longitud y composición única. La PARR amplifica por PCR esta región variable mediante primers (cebadores: fragmentos cortos de ADN, diseñados para unirse a los extremos de la región que se quiere amplificar, que sirven como punto de inicio de la PCR): una población policlonal produce productos de muchos tamaños, mientras que una población clonal produce uno o dos productos dominantes del mismo tamaño (Burnett et al., 2003; Keller et al., 2016). La prueba determina si una población de linfocitos atípicos es monoclonal, lo que generalmente apoya el diagnóstico de linfoma, o policlonal, más consistente con un proceso reactivo.

Muestras

La PARR se puede realizar en aspirados (incluidas laminillas previamente teñidas), sangre, médula ósea, derrames, líquido cefalorraquídeo y, en muchos laboratorios actuales, en tejido fijado en formalina e incluido en parafina (Ehrhart et al., 2019). Las muestras no necesitan ser frescas como para la citometría de flujo, porque se analiza ADN, y no se requiere un gran número de células. Algunos laboratorios todavía no aceptan tejido en parafina, y en general no pueden procesarse laminillas que tengan el cubreobjetos pegado para su conservación, por lo que conviene reservar laminillas sin montar.

La sensibilidad analítica de la prueba, es decir, la proporción mínima de células clonales que puede detectarse dentro de un fondo policlonal, se ha citado clásicamente en alrededor de una célula neoplásica por cada 100 células; sin embargo, estudios recientes muestran que varía ampliamente, desde 1% hasta más de 50%, en función del tamaño del clon neoplásico, del juego de primers y del ADN de la muestra (Hwang et al., 2019).

Desempeño diagnóstico

La sensibilidad y la especificidad de la PARR varían entre laboratorios, porque cada uno utiliza distintos juegos de primers, métodos de análisis y criterios de interpretación (Keller et al., 2016; Hwang et al., 2019). A lo largo de los años, con distintos métodos y juegos de primers, la sensibilidad publicada en el perro ha variado aproximadamente de 68 a 100%, y la especificidad suele ser superior a 90%, aunque los falsos positivos son posibles (Waugh et al., 2016; Ehrhart et al., 2019). En el gato, en cambio, la especificidad es baja cuando se evalúan infiltrados linfocíticos intestinales, como se detalla más adelante. En la siguiente tabla se resumen estudios representativos:

Estudio	Especie y muestras	Resultados principales
Waugh et al., 2016	Perro; 271 muestras consecutivas de rutina	Entre las muestras con resultado claro, 99% de los casos clonales y 84% de los policlonales concordaron con el diagnóstico citológico o histológico; 30 muestras dieron resultados equívocos (picos clonales en fondo policlonal o amplificación escasa).
Ehrhart et al., 2019	Perro; 181 perros; tejido en parafina, pellets de citometría y aspirados secados al aire	Tejido en parafina: sensibilidad y especificidad de 92%. Pellets de citometría: sensibilidad de 85%. Aspirados: sensibilidad y especificidad de 100% (41 laminillas). El desempeño fue menor para asignar el linaje B o T.
Hwang et al., 2019	Perro; revisión y optimización de ensayos para células B	Sensibilidad cualitativa de 80 a 90% con primers optimizados; gran heterogeneidad entre ensayos publicados.
Hammer et al., 2017	Gato; 20 linfomas y 10 controles	Sensibilidad de 70% y especificidad de 90%; valor predictivo positivo de 93% y negativo de 60%.
Freiche et al., 2021	Gato; linfoma intestinal de bajo grado frente a enteritis linfoplasmocítica	Monoclonalidad de TRG en 86% de los linfomas de bajo grado, pero también en 70% de las enteritis linfoplasmocíticas (40% monoclonales y 30% con un clon sobre fondo policlonal).
Marsilio et al., 2019	Gato; biopsias endoscópicas de 20 gatos clínicamente sanos	13 de 20 con resultados clonales; solo 3 gatos desarrollaron signos de enteropatía crónica durante el seguimiento (mediana de 709 días en los que permanecieron sanos).

Resultados falsos positivos y falsos negativos

Clonalidad no es sinónimo de malignidad. Pueden ocurrir resultados falsos positivos cuando unos pocos clones se expanden de forma desproporcionada en respuesta a un estímulo antigénico. En el perro se han descrito resultados clonales en la ehrlichiosis (Burnett et al., 2003) y en la leishmaniosis, donde 3 de 31 perros (9.7%) con linfadenomegalia por Leishmania infantum tuvieron resultados clonales (Melendez-Lazo et al., 2019). En regiones donde las enfermedades transmitidas por garrapatas son frecuentes, como gran parte de México, debe descartarse la ehrlichiosis antes de interpretar un resultado clonal como linfoma. Las muestras con muy pocos linfocitos pueden generar picos aparentemente clonales (seudoclonalidad), y la presencia de un pico clonal sobre un fondo policlonal requiere interpretación cuidadosa (Waugh et al., 2016).

Los falsos negativos ocurren cuando el reordenamiento del clon neoplásico no es reconocido por los primers utilizados, cuando el clon representa una proporción pequeña de la muestra o cuando existe un fondo policlonal abundante por infiltración inflamatoria (Keller et al., 2016). Por estas razones, los resultados de la PARR siempre deben interpretarse junto con la información clínica, morfológica e inmunofenotípica, y algunos laboratorios solo aceptan muestras que incluyan una inmunofenotipificación previa.

Cuándo es útil y cuándo no

La PARR es más útil cuando la citología o la histopatología son equívocas, cuando la muestra es poco celular o no es posible obtener células viables, y en líquidos con pocos linfocitos, como el líquido cefalorraquídeo. También es útil en el linfoma cutáneo epiteliotrópico de células T, cuyo diagnóstico diferencial con dermatitis inflamatorias puede ser difícil: en 45 perros con esta neoplasia se detectó monoclonalidad del gen TRG en 36 (80%) (Moore et al., 2009). Es menos útil en los casos de linfoma ya confirmados: aunque puede orientar hacia el linaje, si el diagnóstico de linfoma es inequívoco, la citometría de flujo o la inmunohistoquímica son mejores pruebas para determinar el fenotipo (Thalheim et al., 2013).

Comparación de las pruebas

Característica	IHQ	ICQ	Citometría de flujo	PARR
Muestra	Biopsia en formalina y parafina	Frotis citológico	Aspirado, sangre o médula ósea en medio de preservación	Aspirado, laminilla, sangre, médula ósea, líquidos; tejido en parafina en muchos laboratorios
Requiere células viables	No	No	Sí (idealmente procesar en menos de 24 h)	No
Evalúa arquitectura	Sí	No	No	No
Inmunofenotipo	Sí	Sí (panel limitado)	Sí (panel amplio y aberraciones)	No es adecuada para asignar linaje
Clonalidad	Indirecta (población homogénea)	Indirecta	Indirecta (población homogénea y aberrante)	Directa (molecular)
Información pronóstica	Subtipo histológico, Ki-67	Limitada	Tamaño celular, MHC II, CD45, Ki-67	Limitada
Principal limitación	Requiere biopsia	Pocas tinciones por laminilla	Transporte y viabilidad de la muestra	Falsos positivos y negativos; variabilidad entre laboratorios

Selección de la prueba adecuada

La inmunohistoquímica, la inmunocitoquímica, la citometría de flujo y la PARR son cada vez más accesibles en la medicina veterinaria. Estas técnicas evitan que se realicen procedimientos más invasivos en los pacientes y con frecuencia son más económicas para el propietario. Sin embargo, no suelen considerarse pruebas de primera línea y muchas veces no son necesarias. Si el diagnóstico de linfoma se ha confirmado por citología o histología, la razón para realizar pruebas adicionales es su valor pronóstico, la confirmación del subtipo (por ejemplo, un linfoma indolente que puede manejarse de manera distinta) o que el tratamiento se vaya a elegir con base en el fenotipo. Estas pruebas son más útiles en los casos equívocos en citología o histopatología; en ese escenario se debe seleccionar la prueba que proporcione la información más relevante, al menor costo y con el menor impacto para el paciente.

Siempre es de gran utilidad consultar con el patólogo o el oncólogo para determinar la prueba o las pruebas más apropiadas. Las siguientes pautas pueden ayudar a elegir la prueba adicional más adecuada después de una evaluación citológica o histopatológica en perros y gatos con linfoma confirm

Situación clínica	Hallazgo	Prueba sugerida
Linfadenopatía u organomegalia	Linfoma confirmado; se necesita el fenotipo	IHQ, ICQ o citometría de flujo
Linfadenopatía u organomegalia	Sospecha de linfoma con citología o histología equívoca y población homogénea de linfocitos	Citometría de flujo o IHQ
Linfadenopatía u organomegalia	Sospecha de linfoma de células pequeñas o de zona T (linfocitos pequeños, con o sin linfocitosis)	Citometría de flujo (pérdida de CD45 y otras aberraciones); histopatología si es posible
Linfadenopatía u organomegalia	Población heterogénea de linfocitos con células sospechosas raras	PARR
Linfadenopatía u organomegalia	Células de origen poco claro	IHQ, ICQ, citometría de flujo (si la muestra es muy celular) o PARR (si no es muy celular)
Localización anatómica difícil	No es posible obtener una muestra muy celular	PARR
Masa mediastínica	Sospecha de linfoma de células pequeñas o timoma en la citología	Citometría de flujo (en el perro); en el gato, PARR e histopatología
Sangre periférica	Linfocitosis	Citometría de flujo
Sangre periférica	Células sospechosas raras, sin linfocitosis	Considerar PARR
Médula ósea	Presencia de linfocitos neoplásicos	Citometría de flujo
Médula ósea	Sin evidencia clara de células malignas	PARR
Líquido cefalorraquídeo	Linfocitosis o linfocitos atípicos	PARR
Gato con enteropatía crónica	Infiltrado linfocítico intestinal; sospecha de linfoma de bajo grado	Histopatología (de preferencia biopsias de espesor completo), IHQ y PARR integradas

ado o sospechado:

Masas mediastínicas

En el perro, la citometría de flujo permite diferenciar el timoma del linfoma mediastínico cuando el aspirado está compuesto principalmente por linfocitos pequeños. En un estudio, todos los timomas tenían 10% o más de linfocitos que coexpresaban CD4 y CD8, el fenotipo característico de los timocitos, mientras que 6 de 7 linfomas tenían menos de 2% de células CD4+CD8+; el único linfoma CD4+CD8+ se distinguió por sus propiedades de dispersión de luz (células más grandes) (Lana et al., 2006). En el gato este criterio es menos útil, porque una proporción alta de los linfomas mediastínicos es CD4+CD8+; en esta especie la PARR y la histopatología siguen siendo necesarias para resolver el diagnóstico diferencial (Bernardi et al., 2020).

Linfoma intestinal en el gato

La diferenciación entre la enteritis linfoplasmocítica y el linfoma intestinal de células T de bajo grado es uno de los mayores retos diagnósticos en el gato. El consenso del ACVIM concluye que ningún criterio aislado ni biomarcador conocido distingue de forma confiable las lesiones inflamatorias de las proliferaciones linfoides neoplásicas en el intestino del gato; el diagnóstico se establece integrando los datos clínicos, de imagen, histológicos, inmunohistoquímicos y de clonalidad, y la histopatología sigue siendo el pilar diagnóstico (Marsilio et al., 2023). La inmunohistoquímica confirma el fenotipo CD3+ del linfoma de bajo grado, mientras que la enteritis linfoplasmocítica muestra una mezcla de células T y B (Freiche et al., 2021; Moore et al., 2012). La PARR es un complemento valioso, pero el mismo consenso advierte que la clonalidad no equivale a malignidad, de modo que un resultado clonal aislado, sin respaldo histológico, no debe considerarse diagnóstico (Marsilio et al., 2023).

En el gato, la PARR intestinal tiene una especificidad particularmente baja, y dos estudios lo ilustran con claridad. En un estudio prospectivo con biopsias de preferencia de espesor completo, se detectó monoclonalidad del gen TRG en 86% de los linfomas intestinales de bajo grado, pero también en 70% de los gatos con enteritis linfoplasmocítica (40% con resultado monoclonal y 30% con un clon sobre fondo policlonal); es decir, la PARR por sí sola no discriminó entre ambas enfermedades (Freiche et al., 2021).

En otro estudio se tomaron biopsias endoscópicas de duodeno a 20 gatos clínicamente sanos de 3 años o más, sometidos a anestesia por procedimientos electivos. Trece gatos tuvieron resultados clonales (8 clonales y 5 con un clon sobre fondo policlonal), y la interpretación integrada de histopatología, inmunohistoquímica y clonalidad fue compatible con linfoma de células pequeñas en 12 de ellos. Sin embargo, durante el seguimiento solo 3 gatos desarrollaron signos de enteropatía crónica: dos con diagnóstico inicial de linfoma, eutanasiados a los 295 y 654 días, y uno con resultado policlonal que mejoró con una dieta de proteína hidrolizada. Los 17 gatos restantes permanecieron sin signos después de una mediana de 709 días (intervalo de 219 a 869 días). Los autores concluyeron que la especificidad de la clonalidad en el gato merece reevaluarse y que no se justifica reclasificar un caso solo con base en un resultado clonal (Marsilio et al., 2019).

Esta interpretación integrada sigue el algoritmo escalonado propuesto para las biopsias intestinales felinas: primero la evaluación histomorfológica, después la inmunofenotipificación y, por último, la PARR, con un diagnóstico final basado en la combinación de los tres resultados (Kiupel et al., 2011). Además, dado que los ensayos de clonalidad no están armonizados entre laboratorios, hace falta una evaluación más amplia de la especificidad de la PARR en el gato que incluya distintos laboratorios de diagnóstico (Keller et al., 2016; Marsilio et al., 2019).

En la práctica, un resultado clonal en una biopsia intestinal felina debe interpretarse como un dato más dentro de la evaluación integrada (signos clínicos, ecografía, histopatología con patrón de infiltración e inmunohistoquímica), y nunca como diagnóstico de linfoma por sí mismo. La PARR tampoco permite establecer el grado del linfoma, que es lo que determina el pronóstico y debe definirse por histopatología.

Valor pronóstico de las pruebas de inmunofenotipo

Además de confirmar el diagnóstico, la inmunofenotipificación aporta información pronóstica relevante para la conversación con el propietario y la elección del tratamiento:

• Inmunofenotipo B frente a T: en los linfomas de alto grado, el fenotipo T se asocia en general con un pronóstico menos favorable que el B (Comazzi y Riondato, 2021).
• Linfoma de zona T (CD45 negativo): curso indolente, con una mediana de supervivencia de 637 días en el estudio de referencia (Seelig et al., 2014).
• Linfoma T CD4+: la mayoría de los casos son CD45 positivos, expresan niveles bajos de MHC de clase II y tienen un curso agresivo (mediana de supervivencia de 159 días), independientemente del protocolo; un subgrupo pequeño CD45 negativo y con MHC de clase II alto tuvo un curso más indolente (Avery et al., 2014).
• Linfoma B: MHC de clase II y tamaño celular:la baja expresión de MHC de clase II y el tamaño celular grande se asociaron de manera independiente con menor supervivencia (Rao et al., 2011), aunque un estudio prospectivo posterior en perros tratados con CHOP no confirmó esta asociación en el linfoma difuso de células B grandes (Wolf-Ringwall et al., 2020).
• Ki-67 por citometría de flujo: un índice de Ki-67 mayor de 12.2% identificó a los linfomas de alto grado con sensibilidad de 96.3% y especificidad de 100%, lo que lo convierte en un complemento útil para estimar el grado a partir de un aspirado (Poggi et al., 2015).

Enfoques emergentes

Las siguientes herramientas se encuentran en desarrollo o en fase inicial de uso clínico. No forman parte del estándar de cuidado para el diagnóstico de linfoma ni sustituyen a la citología, la histopatología y la inmunofenotipificación:

• Clonalidad por secuenciación de nueva generación: analiza miles a millones de secuencias del receptor de antígeno en una sola corrida, identifica los clones por su secuencia y no solo por su tamaño, y reduce la subjetividad en la interpretación de los picos. Permite seguir el clon específico de cada paciente durante y después del tratamiento. En perros con linfoma B se observó la expansión de secuencias IGH específicas antes del tratamiento y su reducción posterior, en correlación con la evolución clínica en un subgrupo de pacientes (Cullen et al., 2022). Su disponibilidad comercial es todavía limitada.
• Enfermedad mínima residual: la citometría de flujo y la PARR se han estudiado para detectar células neoplásicas persistentes en ganglio linfático, sangre y médula ósea de perros en remisión clínica; la concordancia entre ambas técnicas al diagnóstico fue alta en el ganglio linfático y menor en la sangre y la médula ósea (Aresu et al., 2014). Su uso para decidir el tratamiento aún no está validado.
• Biopsia líquida (ADN libre circulante): las pruebas basadas en secuenciación del ADN libre en plasma se han validado como herramientas de detección temprana de múltiples tipos de cáncer. En el estudio de validación más grande, la sensibilidad global fue de 54.7% con una especificidad de 98.5%, y la tasa de detección alcanzó 85.4% para el conjunto de linfoma, hemangiosarcoma y osteosarcoma (Flory et al., 2022). Un resultado positivo no establece el diagnóstico de linfoma y obliga a una evaluación diagnóstica convencional.
• Biomarcadores para la enteropatía crónica felina: se han buscado alternativas menos invasivas para diferenciar la enteritis linfoplasmocítica del linfoma intestinal de células pequeñas. El análisis del proteoma de la mucosa intestinal identificó proteínas con expresión diferente entre gatos sanos y gatos enfermos, pero la confirmación por Western blot no validó ningún candidato para separar la enteritis del linfoma (Marsilio et al., 2021). La haptoglobina sérica fue mayor en gatos con enteritis linfoplasmocítica o linfoma que en gatos sanos, sin diferencia significativa entre ambas enfermedades (Love et al., 2021). Por ahora, ninguno de estos marcadores sustituye a la biopsia.
• Nucleosomas circulantes: los perros con linfoma presentaron concentraciones plasmáticas de nucleosomas aproximadamente siete veces mayores que los controles sanos, con valores más altos en estadios avanzados y en los linfomas B que en los T (Dolan et al., 2021). Los nucleosomas también aumentan en procesos inflamatorios, por lo que esta prueba no es específica de linfoma; su papel más prometedor es el seguimiento de la respuesta al tratamiento.

Puntos clave para el clínico

• La citología resuelve la mayoría de los casos: las pruebas complementarias se reservan para casos equívocos o cuando el fenotipo o el subtipo cambian el pronóstico o el tratamiento.
• Muestreo: evitar ganglios linfáticos de zonas reactivas y reservar laminillas sin teñir y sin cubreobjetos para posibles pruebas posteriores.
• La histopatología con inmunohistoquímica es la prueba de elección: es la única que evalúa la arquitectura y permite la clasificación completa del linfoma.
• Citometría de flujo: es la mejor prueba para determinar el inmunofenotipo a partir de un aspirado y la herramienta clave para reconocer el linfoma de zona T (CD45 negativo); requiere muestra fresca en medio de preservación, procesada idealmente en menos de 24 horas.
• PARR: detecta clonalidad, no inmunofenotipo; es útil en muestras equívocas, poco celulares o no viables, y debe interpretarse siempre junto con la clínica, la morfología y el inmunofenotipo.
• Clonalidad no es malignidad: la ehrlichiosis y la leishmaniosis pueden producir resultados clonales; descartarlas antes de diagnosticar linfoma con base en la PARR.
• Masa mediastínica en el perro: 10% o más de linfocitos pequeños CD4+CD8+ en citometría de flujo apoya el diagnóstico de timoma.
• Gato con enteropatía crónica: la PARR puede ser clonal en la enteritis linfoplasmocítica (70% en un estudio) y en gatos clínicamente sanos que no desarrollan linfoma; el diagnóstico de linfoma intestinal de bajo grado requiere integrar histopatología, inmunohistoquímica y clonalidad, y el grado se determina por histopatología.
• Enfoques emergentes: la clonalidad por secuenciación, la enfermedad mínima residual, la biopsia líquida y los nucleosomas circulantes son prometedores, pero todavía no reemplazan a las pruebas convencionales.

Referencias

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